Diego de Almagro era el hijo de Elvira Gutiérrez y de Juan Montenegro, quienes no se casaron nunca. Como su padre no cumplió nunca la promesa de matrimonio hecha a su madre, Elvira decidió esconder su hijo y enviarlo al cuidado de Sancha López del Peral.

A la edad de cinco años, Diego es recogido por su padre, pero éste muere poco tiempo después. Es entonces confiado a su tío materno, Hernán Gutiérrez, de donde huirá a la edad de quince años.

Habiendo tenido una infancia triste y solitaria, nunca pudo estudiar; no sabía leer ni escribir, pero no estaba desprovisto de virtudes: honesto, franco, generoso y de gran coraje.

Diego de Almagro llega a América en 1514, con la expedición que conquistó Panamá, bajo las órdenes de Pedrarias Dávila (o Pedro Arias de Ávila).
Es allí que conoce a Francisco Pizarro, quien se volverá su socio en una serie de proyectos de conquista. El tercer socio en esta asociación es Hernando de Luque, un religioso que oficiaba en Panamá y que invertirá una gran suma de dinero en estos proyectos.

La amistad entre Pizarro y Almagro comienza a quebrarse en 1526 cuando el primero firma en nombre de todos los socios la Capitulación de Toledo con el rey de España. Por esta Capitulación, el Rey autoriza la conquista del Perú y fija las recompensas que cada uno de los socios podrá recibir. Sin embargo los tres asociados ya se habían puesto de acuerdo mucho antes en repartirse equitativamente los beneficios. Pero tratando con las autoridades españolas, Pizarro obtuvo para él la parte más grande de los beneficios y títulos.
A pesar de eso, Almagro obtiene de todas formas una fortuna importante, y el Rey le acordará, en noviembre de 1532, el título de "don" y el derecho de tener sus propios escudos de armas.

En 1534 Almagro obtiene el título de Gobernador de Nueva Toledo, que comprendía las tierras situadas entre los paralelos de 14 y 25 grados de latitud sur, es decir, de Cuzco hasta Taltal. Según los indígenas, estas tierras serían muy fértiles y ricas en oro.

Almagro pasa cerca de 6 meses preparando su expedición. No encuentra problemas para reclutar hombres en Cuzco y Lima. Con su fortuna personal equipa los soldados que no tienen ningún recurso. Así pudieron equiparse con armas, herramientas, herraduras, pólvora y otros utensilios indispensables. En total, se calcula que la expedición ha costado un millón y medio de pesos castellanos.

Cuando Almagro parte para Chile, el 3 de julio de 1535, la querella con Pizarro con respecto a la ciudad de Cuzco no estaba arreglada, creyendo los dos hombres que ella se encontraba bajo su tutela respectiva.

La ruta tomada por Diego de Almagro y su ejército, compuesto de 500 españoles, 100 esclavos negros y 10000 indios, pasa por el Altiplano Boliviano, bordeando el lago Titicaca, después por Paria, Tupiza, Chicoana, luego hacia el sudoeste atravezando la Cordillera de los Andes por el paso de San Francisco.

El camino es duro y extenuante. El momento más difícil es el cruce de la Cordillera de los Andes; a casi 4000 metros de altitud, el frío, el hambre y la fatiga provocan la muerte de los españoles y los indios, pero más particularmente la de los esclavos negros, poco habituados a esos climas rigurosos. Ciertos dijeron que "a veces, un soldado se detenía para descansar y moría congelado; otro, queriendo retirar sus botas, constataba con horror que sus dedos se habían quedado pegados".

Almagro debe tomar una decisión para salvar la expedición de un fracaso anunciado: ordena a un pequeño grupo de partir adelante en búsqueda de ayuda entre los indígenas. Por suerte, estos hombres encontraron en el valle de Copiapó un español llamado Gonzalo Calvo Barrientos, un delincuente que había sido castigado por las autoridades y que ayuda a los expedicionarios gracias a sus relaciones con los nativos de la zona.
Allí, en el valle del río Copiapó, Almagro toma posesión de Chile en nombre de Carlos Quinto (Carlos V).

Diego de Almagro emprende la exploración del territorio dirigiéndose hacia el valle del río Aconcagua donde es bien recibido por los indígenas. Sin embargo, las intrigas de su intérprete, un indio llamado Felipillo, hacen creer a los indígenas que la intención de Almagro es asesinarlos. Felipillo aconseja a los indígenas atacar a los españoles por sorpresa, pero éstos renuncian a último momento.

Con el fin de proseguir más adelante aún la exploración de tierras y de encontrar las riquezas de las cuales se le había hablado, Almagro organiza la expedición hacia el sur. Envía a Gómez de Alvarado quien, con 70 caballeros, avanza sin encontrar gran resistencia (julio - septiembre de 1536), arrivando a la confluencia del Ñuble y del Itata. En este lugar se produce la primera confrontación entre los españoles y los indios mapuches, la batalla de Reinohuelén.

Al mismo tiempo, Almagro envía a Juan de Saavedra a reconocer las costas a bordo de las embarcaciones venidas del Perú con refuerzos. Saavedra alcanza la zona de Alimapu, que bautiza Valparaíso, que quiere decir Valle del Paraíso.

La exploración hecha por Almagro de la región central, y las malas noticias aportadas por Gómez de Alvarado, lo llevan a pensar que las riquezas se encuentran más allá de la inmensa cordillera. Sin escuchar los consejos de sus lugartenientes decide, en pleno invierno, enviar una expedición que debe hacer marcha atrás el segundo día, mostrándose la empresa irrealizable.

Diego de Almagro no ha encontrado oro ni ciudades, únicamente comunidades indígenas viviendo de la agricultura, y otros, más belicosos, en el sur. A pesar de eso, decide quedarse y fundar una ciudad. Quiere hacer venir a esta región a su hijo nacido de su relación con una indígena panameña, Ana Martínez. Siempre lleno de optimismo, Almagro está listo para emprender la conquista del país. Pero sus compañeros lo presionan para regresar al Perú; el viaje de regreso comienza en septiembre de 1536.

La partida de los españoles de los valles de Chile transcurre con violencia: Almagro autoriza a sus soldados a saquear a los indígenas, y a capturarlos como esclavos. Atados, los indios deben llevar el material de los soldados y son tratados sin compasión.

La expedición decide tomar la ruta del desierto de Atacama. Antes de partir, dando muestras de generosidad, Almagro reune a sus hombres y rompe delante de ellos los documentos que notifican las deudas que ellos habían contraído antes de partir de Cuzco. Con este gesto quiere recompensar a esos rudos y ambiciosos aventureros por su ayuda en su emprendimiento.

El cruce del desierto no es fácil en razón de las condiciones climáticas. Igual que para el cruce del Altiplano, los conquistadores obtienen alimentos de los indígenas, sea por propia voluntad o por la fuerza.

Finalmente, la expedición llega a Cuzco en 1537. La ciudad está sitiada por las tropas indias dirigidas por el Inca Manco II. Almagro, que era un amigo del Inca le pide una entrevista, pero éste último se niega. Temiendo una alianza entre Almagro y Manco, el gobernador Hernando Pizarro siembra la confusión entre los indios quienes atacan la ciudad. Las tropas de Almagro se dispersan pero con los hombres que quedan a sus órdenes, logra poner fin al sitio y toma prisioneros a los hermanos Hernando y Gonzalo Pizarro.

Después de haber ocupado Cuzco, Almagro derrota a los soldados enviados por Francisco Pizarro, bajo las órdenes de Alvarado, durante la batalla de Abancay (el 12 de julio de 1537). Un poco más tarde, Gonzalo Pizarro y Alvarado lograron escapar a la vigilancia de sus carceleros.

Las negociaciones que siguen entre Diego de Almagro y Francisco Pizarro concluyen con la cesión de Cuzco a Almagro a cambio de la libertad de Hernando Pizarro. Pero Pizarro no respeta su parte del trato, y con un ejército que había organizado durante un tiempo, ataca las tropas de Almagro.